Au sein de la famille des Mustelidae, les loutres constituent une sous-famille distincte, celle des Lutrini (Lutrinae), à laquelle appartient le genre Pteronura, auquel la loutre géante est la seule espèce attribuée. L'ouvrage standard Mammal Species of the World (MSW) reconnaît deux sous-espèces, Pteronura brasiliensis brasiliensis et Pteronura brasiliensis paraguensis, mais leur description pas très claire a conduit les chercheurs du passé à décrire de nombreux synonymes. Pteronura brasiliensis brasiliensis est répandu dans la partie nord de l'aire de répartition, dans les systèmes fluviaux de l'Orénoque, du fleuve Amazone et des fleuves Guyane. Au sud, Pteronura brasiliensis paraguensis était présent au Paraguay, en Uruguay, dans le sud du Brésil et dans le nord de l'Argentine, mais pourrait être éteint dans les trois dernières régions. L' Union internationale pour la conservation de la nature (IUCN) considère comme douteuse la présence de l'espèce en Argentine et en Uruguay. En ce qui concerne l'Argentine, les investigations ont démontré la présence de petites populations reliques.
Les analyses phylogénétiques menées par Koepfli et Wayne ont révélé que la loutre géante présentait la divergence de séquence la plus élevée de toute la sous-famille Lutrini et qu'elle constituait un clade distinct qui s'est séparé il y a entre 14 et 10 millions d'années. Les deux chercheurs ont émis l'hypothèse que dans l'arbre phylogénétique, les espèces constituaient une branche basale des loutres ou même sortaient de leur lignée évolutive, s'étant séparées avant même d'autres mustélidés, comme l'hermine, le putois et le vison. Des recherches ultérieures sur le séquençage des gènes des mustélidés, menées à partir de 2005, situent la divergence de la loutre géante à une période ultérieure, entre 11 et 5 millions d'années : l'arbre phylogénétique correspondant identifie la divergence de la loutre comme première branche s'étant divisé entre les Lutrini et les Pteronura en deuxième position, bien que les intervalles de divergence se chevauchent.